受容体釣方法の結果
さて、受容体釣法をへらぶな、バスと試したが
いずれも失敗に終わったので、もう研究はやめるために一応、ここに失敗のレポートをあげておく。
他の人が同じことを考えて、失敗する無駄な実験をしないようにだ。
つーことで、
作成した受容体ワーム
といっても、受容体を含む成分の粉末を混ぜただけ。
効果があるのは最初の１キャストだけだと思う。
ベースはロボのリーチ
山中湖で実験、まったく効果らしいことは認められず、と報告があった。
さて受容体の考え方だが、ある論文を見つけてその論文が正しいか、実証するつもりでいた。
その論文は＜＜続きを読む＞＞の中にある。どこからかのWEBから引用である。
すまんもう昔なのでURLは忘れた。すげー長いよ。
効果はあると思うがいかんせん他に方法が思いつかないので
今後はフォーミュラに混ぜてみるとかしてみるといいかもしれないが
とりあえずバス釣りにはしばらく行けないので効果を計ることはまだ先だ。
ということで惨敗したよという報告である。
また新しい釣法を見つけて実験してみようとおもう。
ちなみにターゲットにした受容体は論文上、最も反応が高いといわれるL-Argであった。
緒言
オオクチバス（Micropterus salmoides）は1925年に赤星鉄馬氏によって、アメリカ合衆国から神奈川県芦ノ湖に初めて移植された(赤星, 1996)。その後、何度かの移植が繰り返されたが、移植されてから44年間は戦争もあり分布の広がりは関東以西の一部に限られていた。1970年以降、新たにアメリカから神奈川県芦ノ湖に5,200尾、愛媛県に1,000尾を移植されたのを含め徐々に分布を拡大していき、1975〜1979年にかけて釣愛好者の急増に伴い、全国的に無秩序に放流されたこともあり、急激に分布域を広げた。現在では、ほぼ日本全土に分布しているとされる（桐生, 1992）。
オオクチバスは、攻撃性が強く、貪欲な動物食性の魚であり、湖沼や河川の生態系において、食物連鎖の頂点にあると思われることから、琵琶湖や霞ヶ浦などでは在来種の仔稚魚等を食い荒らし、固有の生態系に悪影響を与え、漁業に被害を与える害魚とみなされる傾向が強い。しかしその一方では、河口湖のように、ルアー釣りの好対象魚であるオオクチバスの人気を利用し、積極的に放流を行い、遊漁資源として多大な収益を得ている漁業協同組合もあり、そのとらえ方は様々である。
オオクチバスの食性については、淀と木村 (1998)が胃内容物調査を行っており、アメリカザリガニやテナガエビ等の甲殻類、アユやウグイ等の魚類といった水棲動物の他に、水中に落ちたと思われる陸棲昆虫まで捕食していることがわかっている。Lewis et al.（1961）によれば、オオクチバスを飼育している
水槽内に小魚を入れた場合には、即座に食い尽くしてしまうという。またVanderhorst（1967）は、オオクチバスには空腹を満たすという通常の摂餌行動の他に、空腹であろうとなかろうと目の前にある餌と認識されるものには、反射的に食いついてしまうという習性があることことを報告し、ルアーに対する行動は、その典型であると述べている。したがって、オオクチバスには、餌のような動くものは何でも口にしてしまう性質があると思われる。以上のようなことから、オオクチバスの摂餌行動には、視覚器や機械的感覚器によって得られる情報が、重要に関わっていると推測される。
一方、魚類は、視覚器や機械的感覚器の他に、味覚器や嗅覚器といった化学感覚器官を有しており、これらの化学感覚器官から得られる情報も、摂餌行動に重要に関わっていると事は明白である。魚類の味覚器応答に関する研究は、Konishi and Zotterman (1961a、1961b)とTateda（1961、1964）のコイやナマズの一種 Ameiurus melasを対象として行われた研究に始まり、現在までに約20種におよぶ魚類について研究されている。これらの研究は、いずれも淡水産、海産の違いに関わらず、魚類の味覚器がアミノ酸に対して高い感受性を持つという結果を示している。さらに、これらの研究は、魚種によって味覚器が応答するアミノ酸の種類に大きな差異があることも同時に明らかにした。日高（1991）は、海産無脊椎動物、魚類、藻類等の、いわゆる魚類の餌となる生物のエキス中に含まれるアミノ酸の種類やその含有量と、現在までに調べられた17魚種のアミノ酸に対する味覚器応答の特徴、いわゆる応答スペクトルを比較し、両者の間に関連があることを指摘している。例えばアイゴが食するワカメのエキスのアミノ酸組成(高木ら, 1967)と味神経応答(Ishida and Hidaka, 1987)を比較してみるとエキス中にもっとも多い6種類のアミノ酸すなわちアラニン、グリシン、プロリン、トレオニン、グルタミン酸、セリンのすべてが高い感受性を示すアミノ酸に入っていると述べている。 また、魚類の嗅覚器応答に関しても、多くの研究が行われており、現在までに20種以上におよぶ魚類について研究されている。これらの研究は、一部の例外を除いて、魚類の嗅覚器のアミノ酸に対する感受性が、味覚器のそれより高いことを示している。また、Goh et al.（1979）、Goh and Tamura（1980）、Kobayashi and Goh（1985）、Kobayashi and Fujiwara（1987）、Johnsen et al.（1988）の一連の研究によれば、魚類のアミノ酸に対する嗅覚器の応答スペクトルの型は、淡水産と海産の違いや、生息場所の違い、さらには食性の違いなどのに関わらず、どの魚種でも相似していることがわかっている。このことは、魚類の嗅覚はアミノ酸に対して、魚種による特異性がないことを示唆しており、味覚とは特徴が大きく異なっている。水中に生活する魚類の場合は、陸生動物とは異なり嗅覚器も味覚器も共に水溶性物質に反応するのでその機能的分別は不明確と思われがちであるが、これらの事実から、魚類の場合も味覚器は餌を口に入れたり飲み込んだりするための接触受容器として機能し、嗅覚器は、遠隔受容器として、摂餌行動において餌生物の探索等に重要な役割を果たしていると思われる。
前述したように、オオクチバスは、その摂餌行動に視覚器や機械的感覚器から得られる情報が非常に優位に関わっており、身の回りの餌と思われる動く物体は何でも口にしてしまう。彼らの眼球は大きく、視蓋もよく発達していること(Friedlander, 1983)からもこのことは裏付けられる。このような彼らの特異的な、言い換えれば、魚類の中でも極端に特化した摂餌行動様式においても他の魚種でいわれるような化学感覚の関与があるのか、すなわち、オオクチバスが餌を探索するときに嗅覚器が関わることがあるのか、また、餌を口にするときに餌自体が持つ味を味覚器によって味わったり、異なる餌の味を味わい分けることができる能力を持ち合わせているかどうかは、魚類の化学感覚研究の立場から非常に興味深い研究対象となる。オオクチバスは、Friedlander (1983)の研究に見られるように視覚中枢の情報処理の研究対象とされたことはあれ、上述のような観点から、化学感覚の研究対象とされたことは皆無である。しかしながら、オオクチバス釣りのルアーに「匂い付き」や「味付き」と称され、その集魚力やルアーを口の中にとどめておく時間の延長をうたう製品があり、その効果の真偽は不明であるが、釣り人によって釣果に影響するとされたり、全く関与しないと言う人もいて意見が大きく割れていることも事実である。また、最近のKubitza et al.(1997)の研究では、オオクチバスを養殖する目的から、魚粉と大豆粉を主体とするドライペレットにアミノ酸、ベタイン、核酸関連物質を加えて、摂餌刺激効果の検討を行ったところ、アミノ酸やベタインには効果が見られなかったが、IMPを混合すると摂餌刺激に増強効果があることが報告されている。これらのことは、オオクチバスの化学感覚器が摂餌行動において少なからず機能している可能性を示唆するものである。
そこで本研究では電気生理学的な手法を用いて、オオクチバスのアミノ酸や核酸関連物質に対する嗅覚器および味覚器応答の特徴について検討を行った。また、味覚器応答については味の判別能力の観点から電気生理学的交差順応実験を行い味受容器の分類を試みた。
��. 嗅覚器応答に関する実験
材料と方法
(1) 供試魚
1997年7月から10月の間に滋賀県琵琶湖と奈良県津風呂湖においてルアー釣りで採捕したオオクチバスを用いた。採捕したオオクチバスは、エアレーションと水循環ができるように改造した大型クーラー(60・)に入れて大学に持ち帰り、屋内の濾過槽付きFRP循環水槽(800・、水温20℃)で一週間以上飼育した魚を実験に使用した。飼育期間中の餌として金魚(約3g)を適宜与えた。
使用した供試魚は、24個体で、全長24.2〜37.3cm(体長20.1〜31.3cm)、体重187.7〜672.1gの範囲であった。
(2) 嗅電図(EOG)の記録方法
供試魚に筋弛緩剤(Pancronium bromide、 2mg/ml)をリンゲル液で2倍希釈した溶液を、魚体重100g当たり0.05〜0.1mlの割合で筋肉内注射して不動化した。筋弛緩剤投与後、完全に鰓蓋膜の動きが停止するまで約30分間水中で安静状態にした。鰓蓋膜の動きが停止したことを確認した後、魚の体表が乾燥する事を防ぐため、湿らせた布で覆い、木台の上に腹這いにして乗せた。次に供試魚に酸素を供給するために、ビニールパイプを用いて口腔内に呼吸水(RW)を流し込んで鰓を強制灌流した(図1)。嗅覚応答を電気生理学的に記録する方法は、嗅電図(Eelectro-Olfactogram EOG)、嗅神経応答、嗅球の誘起脳波などの方法があるが、今回はEOGを記録方法として採用した。嗅上皮の嗅細胞に匂
い物質が到達すると嗅上皮の外面に負の数mVの電位変化が生じる。これは嗅受容器に引き起こされた受容器電位を反映した電位と考えられ、これが嗅電図(EOG)と呼ばれている。EOGの記録方法はSilver et al. (1976)の方法に準じて行った。すなわち、前鼻孔と後鼻孔を仕切る皮弁を切開し嗅房を露出させ、常にシリコンチューブから人工池水(APW、Bryant et al., 1989)を流し続けた。電極にはリンゲル液(NaCl 7.5g/ ・、KCl 0.2g/・、CaCl２2H２O 0.457g/・)にカンテン(0.5重量％濃度)を溶かしたものを充填したガラス細管を付けた甘汞電極(不分極性電極),(図2)を二本用い、一方のガラス細管の先端を嗅板表面の嗅上皮に接触させない程度でできるだけ近づけ、もう一方を鼻腔からあふれる水に触れない体表に接触させ、嗅上皮の電位変化を記録した。嗅上皮を刺激物質で刺激したときに甘汞電極によって導出される嗅上皮の活動電位は、図1に示すように高感度前置増幅器(HGA)で増幅し、ペンレコーダーで記録した。EOGによって記録される嗅上皮の電位は、刺激物質によって嗅細胞が興奮した際には、マイナス側に変化するので、ペンレコーダーによる記録は分かりやすいように電位の陰陽を逆転させて記録した。ちなみに刺激物質の種類のよっては嗅上皮外面が正の陽性EOGを生じる場合があるがこれは嗅板の支持細胞の分泌活動に由来するものであり嗅受容器電位と関係ないとされている。反応の大きさは基線からの反応の高さを計測することにより計測した。また、嗅上皮の電位状態を監視する目的でオシロスコープを使用した。
(3) 刺激方法
嗅房内に刺激溶液を流し込む際に、水圧の変化による物理的刺激をできるだけ少なくするために、図1に示すようなＹ字流路を持つ電磁弁を使用した。まず一方の流路からは絶えず人工池水を流し続けておき、刺激を行う際には電磁弁で流路を切り替えて、もう一方の流路からロート内の刺激溶液が、シリコンチューブ内を通ってすみやかに流れ込むようにした。刺激時間は5秒とし、刺激を繰り返す場合には嗅上皮と刺激装置を人工池水で十分に洗浄した後さらに4分間、人工池水を嗅房内に流し続けて休息時間をとった。実験は、スタンダードとしてL-グルタミンの10−４M溶液を用い、これに対する応答を随時記録し、応答の再現性を確認しながら進めた。なお、実験中の室温は20℃に設定した。
(4) 刺激物質および濃度
使用した物質を表1に示した。また表1中の( )内にはその物質の略号を付した。以下本文中では、この略号を用いて示すこととする。これら24種類の試薬(ナカライテクス社製)は全て人工池水に溶かして刺激液とした。刺激液のpHは必要に応じて塩酸、もしくは水酸化ナトリウム溶液を用いて、pH7.0前後に調整した。なお実験期間中に使用した人工池水のpHは6.90〜7.20の範囲であった。
結果
図3に示した棒グラフは、嗅上皮を各種刺激液10−４Mを流して刺激したときの応答率を、L-Gln 10−４Mに対する応答を100としたときの相対値で表したものである。なお、図中では、二標本t検定(表2)により、危険率1％で黒塗りの棒で示した刺激物質にのみ、コントロールとして使用した人工池水よりも有意に大きな応答が得られたことを示している。図3に見られるように、オオクチバスの嗅覚器は、今回使用したほとんどのアミノ酸で反応が認められた。図3 では反応の大きかった順に並べた。反応の高さはスタンダードであるL-Glnが一番高く、ついで L-Argがその94.66％、 L-Metが93.73％、L-Ornが90.86％、 L-Hisが90.34％そして L-Lysが85.96％でこれらのアミノ酸に対する応答が高かった。10−４Mで反応が認められなかったのはBetとL-Proのみであった。図4にスタンダードであるL-GlnとコントロールであるAPWそしてL-Proに対する応答のEOG記録例を付した。図の上部の目盛りが落ちているところが刺激時間で、記録ライン上の刺激時間の前後にでる反応のようなものは電磁弁の切り替えによるノイズである。
次に図5に応答の大きかったアミノ酸L-GlnとL-Ornの10−８M〜10−４M間での嗅覚応答の記録例を示した。また図6と図7に10−４Mでの応答の大きかった6種のアミノ酸(L-Gln、L-Arg、L-Met、L-Orn、L-His、L-Lys)の濃度-応答曲線を示した。また図8にL-ArgとD-Argの記録例を、図9にL-HisとD-Hisの記録例を示した。閾値はL-Ornが調べたアミノ酸の中で最も低く10−８M〜10−７Mの
間にあった。その他の図中の物質の閾値はL-Arg、L-Met、L-LysおよびL-Hisが10−７M〜10−６Mの間であり、10−４Mでの応答が一番高かったL-Glnの閾値は10−６M付近であった。
図10にL-ArgとD-ArgおよびL-HisとD-Hisの濃度-応答曲線を示した。これからわかるように、それぞれの閾値はL-Argが10−７M〜10−６Mの間、D-Argが10−５M〜10−４Mの間、L-Hisが10−７M〜10−６Mの間そしてD-Hisが10−５M〜10−４Mの間であった。これよりArgとHis両者の場合とも同じようにL型の閾値の方がD型の閾値よりも100倍近く低いことがわかった。
考察
小林と郷 (1991)は、魚類のアミノ酸に対する嗅覚応答の特徴として、調べられたほとんどの魚種においてL-Gln、L-Ala、L-Argがもっとも強い刺激物質であるという共通点を述べている。一方、味覚器に対しては強い刺激効果を持つL-Proは嗅覚においてはもっとも弱い刺激効果しか示さないことも指摘している。さらに、Goh et al. (1979)は、各種アミノ酸の嗅覚刺激効果を他の研究者が発表したデータも含むいろいろな魚種で調べ、刺激効果の大きいものの順に並べた嗅覚のアミノ酸応答スペクトルともいうべきものを作ってみると、淡水魚と海産魚、遊泳性と底生性であるか、さらに草食性か肉食性であるかなど、いわゆる魚類の生態に関わらず、どの魚類でもほぼこのスペクトル型が似ていることを指摘している。例えばGoh et al. (1979)は、マダイ、コイ、ニジマスそしてchannel catfishについて応答スペクトルの相関を相互にとって報告している。それによるとchannel catfishとニジマスの組み合わせがＲ=0.59(P<0.01)であり低い相関を示したが、そのほかの組み合わせにおいては R=0.78〜0.92(P<0.01)と非常に高い相関を示すと述べている。この結果に対して、今回調べたオオクチバスのアミノ酸に対する嗅覚応答の特徴もGoh et al. (1979)が指摘したアミノ酸応答スペクトルは魚種が違っても大きく変わらないと言う定説に当てはまるかどうかを、同様の観点から調べてみた。表3と図11にオオクチバスと他の魚種(ブリ、マダイ、コイ、channel catfish)とのアミノ酸応答スペクトルの相関を示したが、これに示されるように、応答スペクトルの相関係数は、
回遊性の海産魚であるブリ(Kobayashi and Fujiwara, 1987; 森田, 1987)と比較した場合にR=0.68〜0.72(P<0.01)、底生性の海産魚であるマダイ(Goh et al., 1979; Kobayashi and Goh, 1985)と比較した場合にR=0.73〜0.77(P<0.01)、雑食性の淡水魚であるコイ(Goh and Tamura, 1978)と比較した場合にR=0.74(P<0.01)、底生性の淡水魚である channel catfish (Caprio, 1978)と相関をとった場合 R=0.58(P<0.1)であった。channel catfishの場合には調べられているアミノ酸が少なく自由度が低かったため確かなことがいえないのであるが、その他の比較において、オオクチバスのアミノ酸に対する嗅覚応答の特徴は非常に他の魚種のそれと相関が高く応答スペクトルの型が類似していることが分かった。
次に嗅覚のアミノ酸応答閾値についても現在までに調べられている他の魚種との比較を行った。現在まで、魚類のアミノ酸に対する嗅覚応答の電気生理学実験が20例報告されており、これらの結果からわかることは、アメリカウナギ(Silver, 1982)のL-Glnの閾値はEOGの場合で10−７．８±１．２M(嗅神経インパルスの場合 10−９．６±１．９M)、 channel catfish (Caprio, 1978)のL-Cysの閾値はEOGの場合で10−８．８±０．８M(嗅上皮インパルスの場合10−９．１M)、大西洋サケ(Sutterlin and Sutterlin, 1971)のL-Ala 3.2×10−９M(嗅上皮インパルス)が調べられている中で突出しており、これらの魚種は驚異的な嗅覚感度を示す。また、その他の魚種(コイ、メクラウナギ、ギンザケ、ベニザケ、ニジマス、Char Salvelinus alpinnus、カワマス、Whitefish Coregonus clupeaformis、ソウギョ、ナマズの一種 Ictalurus catus、マアナゴ、 ボラ、マダイ、ブリ、sea catfish Arius felis)での、もっとも感度の良いアミノ酸は種類こそ多少異なるが、その閾値はほとんどすべて10−８M〜10−６Mの間にあったとされている(小林と郷 1991)。一方今回の実験結果から得られたオオクチバスの嗅覚応答の場合はもっとも低かったL-Ornの場合は10−８M〜10−７Mの間に、また調べたその他のアミノ酸の閾値のほとんどが10−７M〜10−６Mの間であったこと、から、オオクチバスの場合も、他の魚種と同程度の嗅覚感度を持ち合わせており、嗅覚器は他の魚種と同様の遠隔受容器としての役割を果たしていると推測される。魚類における嗅覚器は索餌行動、生殖行動、個体臭識別および群形成、恐怖反応、忌避行動、定位･回遊行動に関わる(原, 1977)と考えられているが、中でも、索餌行動において嗅覚器が関わっていることは、Sheldon(1911)、Parker(1910、1914)の研究から明らかである。またHoese and Hoese (1967)、Hashimoto et al. (1968)、 Konosu et al. (1968)による行動の研究で、魚を引きつける餌物質中の有効成分はアミノ酸であることが明らかにされている。同様のことはSutterlin (1975)やCarr et al. (1976)の研究でも指摘されている。これらの研究では、魚の誘引行動に嗅覚器が関与しているという直接の証拠はなくアミノ酸は味覚においても重要な刺激物質なので、真理のほどは定かではないが、嗅覚のアミノ酸に対する応答閾値は極めて低く、関与の可能性は十分に考えられる。したがって、他の魚種と同様の嗅覚器の性質を持つと思われるオオクチバスの場合もアミノ酸に嗅覚刺激によって索餌行動が解発される可能性があると考えられる。
D型アミノ酸の嗅覚応答に関しては、後述の味覚において観察されたようなオオクチバスに特異的であると思われる結果は得られなかった。すなわち、L-Arg 10−４Mの94.66％、L-His 10−４Mの90.34％の応答と比較して、同濃度でのD-Arg、D-Hisの応答はそれぞれ51.13％、71.06％でいずれもD型の方が低い (図9)という結果で、嗅覚器刺激効果はD型の方が低いという結果となった。魚類の嗅受容器に関しては、原 (1981)やCaprio (1988)の総説に詳しいが、同様のD型の刺激効果がL型のそれに劣るという結果は、アミノ酸の種類こそ違うが、ギンザケのAlaとSerとMet(Hara, 1972)、大西洋サケのAlaとSerとMet(Hara, 1972)、ニジマスのAlaとSerとMet(Hara, 1973)、カワマスのAlaとSer(Hara et al., 1973)、sea catfishのAlaとMet(Caprio, 1980)、マダイのSerとGln(Goh et al., 1979)、アメリカウナギのGln(Silver, 1982)など多くの魚種で報告されている。これは、嗅覚受容器にはα-アミノ酸のL型のみが生物学的濃度で有効であるという原(1981)の指摘とも一致し、ここでもオオクチバスの嗅覚器応答の特徴が、他の魚種と類似しているという結果なった。
��. 味覚器応答に関する実験
材料および方法
(1)供試魚
1995年9月から10月の間と1996年6月に滋賀県琵琶湖と奈良県津風呂湖においてルアー釣りで採捕したオオクチバスを用いた。採捕したオオクチバスは、エアレーションと水循環が出来るように改造した大型クーラー（60・）に入れて大学に持ち帰り、屋外のFRP水槽（2t）で2週間以上飼育し、その後室内の濾過槽付きFRP循環水槽（800・、水温20℃）で約1週間飼育した魚を実験に使用した。飼育期間中の餌として金魚（約3g）を適宜与えた。
使用した供試魚は、18個体で、全長18.2〜32.8cm（体長14.8〜27.6cm）、体重73.9〜484.2gの範囲であった。
(2)味覚神経応答の記録方法
供試魚に筋弛緩剤（Pancuronium bromide、2mg/ml含有、商品名ミオブロック、オルガノン社製）をリンガー液で2倍希釈した溶液を、魚体重100g当たり0.15〜0.2mgの割合で筋肉内注射して不動化した。その後、アルミホイルをひいた木台に背部を下にして乗せ、体表を湿らせた布で覆い、体表が乾燥するのを防いだ。また、呼吸水が逆流せず、刺激液も口腔内をスムーズに流れるように頭部を少し高くして木の台に乗せ、鰓蓋を少し開いた。次に供試魚に酸素を供給するために、ビニールパイプを用いて口腔内に呼吸水(RW)を流し込んで鰓を強制潅流した（図12）。顔面神経口蓋枝（ramus palatinus facialis）の露出手術は
Hidaka et al.(1985)の方法に準じた。すなわち、鰓蓋膜の運動停止を確認した後、眼球を摘出し、眼窩内の脂肪や筋肉等の電極挿入時に邪魔になる組織で、味覚神経に影響がないものを除去した後、眼窩の最深部中央よりを動脈に沿って走っている第7脳神経口蓋枝を露出させて、中枢側で切断し、末梢側を眼窩内に挿入した双極の白金電極(E)の上に跨ぐように乗せた。神経の乾燥は、眼窩内を流動パラフィンで満たすことにより防いだ。
口蓋を刺激物質で刺激した場合に白金電極によって導出される味覚神経の活動電位は、図12に示すようにまず前置増幅器(PA)で増幅し、次に積分器（INT; 時定数0.1秒）を用いて平均化したものを、主増幅器(MA)で増幅して、ペンレコーダー(PR)で記録した。また、味覚神経の放電状態を監視する目的でオシロスコープ(OS)およびサウンドモニターを使用した。
(3)刺激方法
口蓋部に刺激溶液を流し込む際に、水圧の変化による物理的刺激をできるだけ少なくするために、図12に示したようなＹ字型の流路を持つ電磁弁を使用した。まず一方の流路からは絶えず人工池水(APW; Bryant et al., 1989)を口蓋部に流し続けておき、刺激を行う場合には流路を切り替えて、もう一方の流路からロート内の刺激溶液が、シリコンチューブ内を通って口蓋部にすみやかに流れ込むようにした。刺激時間は3秒とした。刺激を繰り返す場合には口蓋部と刺激装置を人工池水で十分に洗浄した後、さらに3分間、人工池水を口蓋部に流し続けて休息時間をとった。実験は、L-アルギニンの10−２Mに対する応答を随時記録し、応答の再現性を確認しながら進めた。なお、実験中の室温は
20℃に設定した。
(4)刺激物質および濃度
使用した物質を表4に示した。また表4中の（ ）内にはその物質の略号を付した。以後本文中では、この略号を用いて示すこととする。これら39種類の試薬（ナカライテクス社製）はすべて人工池水に溶かして刺激液として用いた。刺激液のpHは必要に応じて塩酸、もしくは水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.0前後に調整して用いた。
結果
(1)アミノ酸およびベタイン
図13に示した棒グラフは、10−２Mにおける各種アミノ酸およびベタインに対する味覚器応答の大きさを、L-Arg 10−２Mに対する応答を100としたときの相対値で表したものである。なお、図中では、二標本t検定（表5）により、危険率5%で黒塗りの棒で示した刺激物質にのみ、コントロールとして使用した人工池水（APW）よりも有意に大きな応答が得られたことを示している。図13に見られるように、オオクチバスの味覚器は、アミノ酸ではL-Arg＞D-Arg＞L-Lys＞D-His＞D-Lys＞L-Hisの順で有効な値を示した。一方、現在まで味覚器応答が調べられている多くの魚種で有効なアミノ酸とされるL-Ala、Gly、L-Pro等に対しては、10−２Mで有効な応答は認められなかった。図14に応答の大きかった上位2つのアミノ酸であるL-ArgおよびD-Argの10−６M〜10−２Mまでの積分応答の記録例を示した。また、図15に応答の大きかったアミノ酸5種(L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-His)の濃度-応答曲線を示した。閾値はL-Argが調べたアミノ酸の中で最も低く、10−５M〜10−４Mの間にあった。D-Argに対する応答は、調べた10−５M〜10−２Mのいずれの濃度においてもL-Argのそれと比較して、若干ではあるが少し低い傾向が見られた。また、閾値は10−４M付近にありL-Argよりも若干高かった。一方、10−２Mで有効な応答の得られた他のアミノ酸の閾値はL-Argと比較して、100倍以上高かった。たとえば、L-LysおよびL-Hisの閾値は10−３M〜3×10−３Mの間に、D-Lysでは3×10−３M〜10−２Mの間
にあるという結果が得られた。
(2)核酸関連物質
図16に示した棒グラフは、核酸関連物質の10−２Mでの味覚器応答の大きさを、L-Arg 10−２Mに対する応答を100とした相対値で表したものである。なお、図中では、二標本ｔ検定（表6）により、危険率5％で黒塗りの棒で示した刺激物質に対してのみ、コントロールとして使用したAPWよりも有意に大きな応答が得られたことを示している。図16に見られるようにオオクチバスの味覚器は、10−２MにおいてADP＞Ino＞ATP＞GMP＞IMP＞AMP＞（L-Arg）＞Ado＞UMP＞CMPの順で有効な応答を示した。図17に応答の大きかったADPおよびInoとスタンダードである L-Argの10−６M〜10−２Mでの積分応答の記録例を示した。また図18に応答の大きかったヌクレオチド5種（ATP、ADP、AMP、IMP、GMP）の濃度-応答曲線を示した。閾値は ADPが調べたヌクレオチドの中で最も低く、次いで AMPであった。両者とも10−５M〜10−４Mの間に閾値があったが、10−４Mでの応答はL-Argのそれよりも明らかに多きく、したがって閾値はL-Argのそれよりも多少低いことを示した。また両者とも、調べた10−５M〜10−２Mのいずれの濃度においてもL-Argよりも少し高い傾向が見られた。一方、他のヌクレオチド（ATP、IMP、GMP）は、閾値が10−４M付近にあり上記のヌクレオチドと比較して10倍ほど高い閾値を示し、閾値に関しては、L-Argとは大きな差が見られなかった。図19に応答の大きかった2種（Ino、 Ado）のヌクレオシドの濃度-応答曲線を示した。Inoの閾値は、本実験で調べ
たすべての物質中で最も低く、10−６M〜10−５Mの間にあった。これは、Adoが10−４M〜10−３Mに閾値があることと比較して約100倍ほど低い値であると共に、10−２Mで応答の最も大きかったADPよりも10倍近く低いことを示す結果が得られた。
考察
今回の実験でオオクチバスの味覚器は、調べたアミノ酸のうち 10−２Mで L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lysに対し比較的大きな応答を示した。また閾値の最も低かったアミノ酸はL-Argで、それは10−５M〜10−４Mの間にあった。一方、L-His, D-Hisに対しても10−２Mでは応答があったが、それはL-Argの50％以下という値であった。したがってオオクチバスの場合、よく応答するアミノ酸が限定されていること、しかもこれらのアミノ酸は塩基性アミノ酸であるということも興味深い点である。
日高（1991）の示した図から、現在までアミノ酸に対する味覚器応答が調べられている他の魚種の特徴をみてみると、多くのアミノ酸にまんべんなく応答する魚種と、数種類のアミノ酸にのみ応答する魚種があることに気づく。例えばchannel catfish、シマイサキ、マダイ、アイゴは前者である。これらの魚種の食生態は、比較的動きの鈍い甲殻類や環形動物、運動性に欠ける貝類や藻類等の餌を自ら探したりして捕食するものである。自然界において味覚器を刺激する物質は必ず混合物の状態で存在するので、複雑な情報を解析するという観点に立てば、多種のアミノ酸に味覚器が応答するということは有利であると思われる。また、channel catfish（Calpio, 1975、1978）やシマイサキ（Hidaka and Ishida, 1985）のようにアミノ酸に対する感度が10−１０Mに達する魚種が含まれる点もあげられる。一方、応答するアミノ酸の種類が比較的少ない後者に含まれる魚種では、例えばブリ、カンパチ、ニジマスがあげられる。これらの魚は活発に泳ぎ回り、動きの速い小魚等を追いかけて捕食する。また前者の魚種と比較してアミノ酸に対する感度も概して低い。以上のような観点からみてみると、活発に泳ぎ回り攻撃的な摂餌行動をするオオクチバスの味覚器が限られたアミノ酸にのみ応答することは、魚類の摂餌生態と味覚器の応答性との関連を考える上で興味深い一知見である。しかしながら緩慢に泳ぎアサリ等を好んで食べるヒガンフグの味覚器は限られたアミノ酸にのみ応答し、その感度もchannel catfishやシマイサキほどよくはないことから摂餌生態と味覚器の応答性の関連は慎重に論じなくてはならないと思われる。
一方、現在までアミノ酸に対する応答が調べられている魚種との比較において、オオクチバスの特異的な点は、ほとんどの魚種で、10−２Mの濃度では、少なくともPro、Ala、Glyの3種のアミノ酸に応答がみられるのに対し、オオクチバスは、これらのアミノ酸に全く応答しないことである。これらのアミノ酸に応答しない魚種は、現在まで大西洋サケ(Sterlin and Sterlin, 1970)が報告されているが、この魚種は調べられた全てのアミノ酸に応答しない。前述したように自然界では、味覚器を刺激するアミノ酸は、いわゆる混合液として存在する。したがってアミノ酸受容において2つ以上のアミノ酸の違いを認識できるということは、重要であると思われる。この問題は味細胞の細胞膜上に存在する受容サイトの類別と同時に、味覚神経がどのようなパターンで情報を中枢に送っているか、さらには中枢における解析過程も十分に考慮する必要があるが、アミノ酸受容の最も最初の段階で受容サイトが異なることは必須条件である。例えば、ヒガンフグ（Kiyohara et al., 1975）、channel catfish（Caprio and Tacker, 1977）、ブリ（Zeng and Hidaka, 1990）では、前述のL-AlaとL-Proに対してAla受容器、Pro受容器の2種類のアミノ酸受容器は独立して存在する。一方、オオクチバスは、L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lysに高い応答を示すが、これらはすべて塩基性アミノ酸である。L-Alaは中性アミノ酸、L-Proは複素環を持つアミノ酸で分子構造も大きく異なることから、受容サイトも異なる可能性が高いが、L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lysのように分子構造の類似するアミノ酸に関しては、受容サイトを共有している可能性もある。一方、Wegert and Caprio（1991）はchannel catfishを用いて電気生理学的交叉順応実験を行いAla、Pro、ArgにおいてL型アミノ酸とD型アミノ酸の受容サイトは互いに独立していると報告している。またMichel and Carpio（1991）およびMichel et al.（1993）もsea catfishを用いて単一味覚神経標本と交差順応実験により、L型AlaサイトとD型Alaサイトが独立していることを述べている。したがってオオクチバスの場合もL型とD型のアミノ酸受容サイトは独立しているという可能性もあるので、今後は交叉順応実験や単一味覚神経繊維を用いた実験が必要であると考えられる。
核酸関連物質では、オオクチバスは調べた13種類のうちヌクレオチド7種、ヌクレオシド2種の計9種類の物質に応答した。また10−２Mの濃度での応答は、L-Argの応答を超えるものが6種あった。現在までに核酸関連物質に関して味覚器応答が調べられている魚種のうち、マダイとボラ（Goh and Tamura, 1980）では、AMP、ADP、ATP、IMP、GMP、Adoのいずれにしても応答しないことが報告されている。一方で、ヒガンフグ（Kiyohara et al., 1975, Hidaka et al., 1976）、シマイサキ（Hidaka and Ishida, 1985）、モツゴ（Kaku et al., 1980）、イサキ、マアジ、ブリ、カンパチ、マサバ（Ishida and Hidaka, 1987）は、AMP、ADP、ATP、IMP、UMP等のヌクレオチドに応答することがわかっている。これらの魚では、共通してUMPに対する応答が高く、調べた濃度でのUMPの応答と他の核酸関連物質に対する応答を比較すると、高くても同等、あるいはほとんどの物質で低い値を示している場合が多い。一方、オオクチバスの場合は、UMPに対し10−２M で応答は認められたが、他の核酸関連物質と比較してかなり低い (58.24％)値を示した。清原（1994）は、AMP、ADP、ATPに対する応答において、ヒガンフグ、イサキ、マアジでは、AMP、ADP、ATPとリン酸基が増えると応答が増加し、逆のことがブリにおいてみられることを指摘している。一方、オオクチバスにおいてもこれらのヌクレオチドは、非常に有効であるが、その応答の大きさはADP、ATP、AMPの順となった。加えて応答の大きさに順位があるかどうか検討するため二標本ｔ検定を行ったが（表7）、三者のどの組み合わせにおいても有意な差は認められなかった。
核酸関連物質の閾値に関してみてみると、Inoに対する閾値は10−６M〜10−５Mの間であり、L-Argのそれと比較すると100倍近く低い値を示している。また、ヌクレオチドではADPとAMPがL-Argよりも閾値が多少であるが低かった。現在までに調べられている魚種で、アミノ酸と核酸関連物質に対する応答閾値を比較すると、ほとんどの魚種で核酸関連物質の閾値がアミノ酸の閾値より
も、 10〜100倍ほど高いという結果が得られている。例えばアイゴ (Ishida and Hidaka, 1987)でProの閾値が10−８M〜10−６Mであるのに対して、ATP、UMPのそれは10−４M付近である。またカンパチ（Ishida and Hidaka, 1987)でのProの閾値は、10−６M〜10−５Mであるのに対して、UMPは10−５M〜10−４Mである。さらにはシマイサキ（Hidaka and Ishida, 1985)で Glyの閾値が10−１０M〜10−８Mであるのに対して、UMPは10−６M〜10−４Mである。したがってオオクチバスの味覚器において、アミノ酸よりも核酸関連物質の閾値が低いという事実は今まで全く報告されていない事例であり、この点においてもオオクチバスは特異な存在である。
オオクチバスの味覚器のアミノ酸に対する応答と餌となる可能性のある生物のアミノ酸の含量（藤田, 1988)を比較すると以下のことがわかる。 すなわちコイの筋肉中に含まれるアミノ酸で多い方から5つ挙げると His、Tau、Gly、Lys、Alaの順となり、このうちオオクチバスの味覚器を刺激するアミノ酸として可能性のあるものは L-His（205mg/100g筋肉）、L-Lys（48mg/100g筋肉)である。同様にアユではLys（56mg/100g）とHis（48mg/100g)があげられる。この含有量で、エキスが100％の濃度で口腔内に滲出した場合を考えると、一番含有量の多いコイのHisにおいて、その濃度は1.3×10−２Mである。同様にLysは3.3×10−４Mであって、アユのLysが3.8×10−４M、Hisが3.1×10−３Mとなっている。これらを図15の各種アミノ酸の閾値と比較すると、Hisでわずかにその閾値に達するのみである。一方、鴻巣と品川（1988）は甲殻類のアミノ酸含有量について、Glyが全種を通じて多いが、それと共にArgも重要な含有アミノ酸の1つであると述べている。例えば鴻巣と品川 (1988)よると、オオクチバスが年間を通じて頻繁に捕食（淀と木村, 1998）しているテナガエビやアメリカザリガニの筋肉中の Arg含有濃度は、順に1.8×10−３M、3.5×10−３M前後であり十分に閾値に達することが判断できる。一方、Okuma et al.（1995）によってD型のアミノ酸の含有量について明らかにされている生物のうち、オオクチバスが捕食する可能性のあるものは、アメリカザリガニである。その筋肉中のD型のアミノ酸の含有量はAlaが最も多く3.23×10−３Mである。しかし、オオクチバスは10−２MのD-Alaには全く応答を示さないことから、感受することはできないと思われる。また、オオクチバスが10−２Mで応答の大きかった
D型のアミノ酸、例えば、D-Argは3.2×10−６M（全Arg中0.07％）、D-Hisは 3.23×10−５M（全His中6.70％）程度しか筋肉中に含まれておらずオオクチバスの味覚器の応答閾値にはるかにおよばない。
魚類の筋肉中では総ヌクレオチドの90％以上がアデニンヌクレオチドで、休息筋肉ではその80％以上がATPであるとされる（藤田, 1988）。ATPはAMPを経てIMPになり、IMPはやがてInoとHypに分解される。そこで、既往の魚肉エキスの分析結果をもとにATP関連物質がすべてATPであったと仮定して、例えばアユ（須山ら, 1977）やコイ（小畠ら, 1985）を捕食したときに味覚器がATPを感受できるかどうかについて考えてみた。アユの場合、ATP換算濃度は1.5×10−３Mになる。一方、ATPに対する閾値が10−４M付近であることから十分に味覚器を刺激し得る濃度であることが分かる。また、コイでは9.7×10−４Mになり、これも十分に味覚器を刺激し得る濃度である。したがって、アミノ酸や核酸関連物質を含むエキス成分に限って考えてみると、オオクチバスがエサを口に取り込むときに何らかの理由で餌生物の体からエキスがにじみ出た場合には、これを味わっている可能性がある。
��. 味受容器に関する実験
材料および方法
(1)供試魚
1996年9月から12月の間に、滋賀県琵琶湖、三重県七色ダム湖、君ヶ野ダム湖、奈良県津風呂湖においてルアー釣りで採捕したオオクチバスを用いた。採捕したオオクチバスは、エアレーションと水循環が出来るように改造した大型クーラー（50・）に入れて大学に持ち帰り、屋外のFRP水槽（2t）で1週間以上飼育し、その後、室内の濾過槽付きFRP循環水槽（800・、水温20℃）で約1週間飼育した魚を実験に使用した。飼育期間中の餌として金魚（約3g）を適宜与えた。
使用した供試魚は、40個体で、全長24.0〜35.6cm（体長20.1〜29.7cm）、体重156.7〜604.8gの範囲であった。 (2)味覚神経応答の記録方法
供試魚に筋弛緩剤（Pancuronium bromide、2mg/ml含有、商品名ミオブロック、オルガノン社製）をリンガー液で2倍希釈した溶液を、魚体重100g当たり0.15〜0.2mgの割合で筋肉内注射して不動化した。その後、アルミホイルを敷いた木製の台に背部を下にして乗せ、体表を湿らせた布で覆い、体表が乾燥するのを防いだ。また、呼吸水が逆流せず、刺激液も口腔内をスムーズに流れるように頭部を少し高くして木製の台に乗せ、鰓蓋を少し開いた。次に供試魚に酸素を供給するために、ビニールパイプを用いて口腔内に呼吸水（RW）を流し込んで鰓を強制潅流した（図20）。顔面神経口蓋枝（ramus palatinus facialis）の露出手術はHidaka et al.（1985）の方法に準じた。すなわち、鰓蓋膜の運動停止を確認した後、眼球を摘出し、眼窩内の脂肪や筋肉等の電極挿入時に邪魔になる組織で、味覚神経に影響がないものを除去した後、眼窩の最深部中央よりを動脈に沿って走っている第7脳神経口蓋枝を露出させて、中枢側で切断し、末梢側を眼窩内に挿入した双極の白金電極（E）の上に跨ぐように乗せた。神経の乾燥は、眼窩内を流動パラフィンで満たすことにより防いだ。
口蓋を刺激物質で刺激した場合に白金電極によって導出される味覚神経の活動電位は、図20に示すようにまず前置増幅器（PA）で増幅し、次に積分器（INT；時定数0.1秒）を用いて平均化したものを、主増幅器（MA）で増幅して、ペンレコーダー（PR）で記録した。また、味覚神経の放電状態を監視する目的でオシロスコープ（OS）およびサウンドモニターを使用した。
(3)刺激方法および交差順応実験の手順
口蓋部に刺激液を流し込む際に、水圧の変化による物理的刺激をできるだけ少なくするために、図20に示したようなＹ字型の流路を持つ電磁弁を2個（sv1、sv2）と、同形のロートを2個（R1、R2）使用した。交差順応実験を行う場合、これら2個の電磁弁を、複雑、かつ正確に操作しなくてはならないので、電子タイマーを用いて弁の開閉を制御した。その制御手順を以下に示す。なお、これより以降、順応に使用する刺激溶液を順応液、実際に応答性を調べる刺激溶液を刺激液と呼ぶことにする。
1. 刺激を行う前にはsv2の一方の流路から絶えず人工池水（APW；Bryant et al. 1989）を口蓋の刺激部位に流しておき味覚器を人工池水に順応しておく。また、刺激を行う前の刺激溶液装填の際には、sv2の弁のところまでロートR1内の順応液が入っているようにする（図21-a）。
2. 刺激を行う場合には、まず、sv2の弁を開く。開く時間は10秒間である。このとき、sv1の弁は閉じている状態なので、これによりロートR1内の順応液が口蓋部に向けて流れる（図21-b）。
3. sv2の弁を開いてから5秒後に、sv1の弁を開く。開く時間は5秒間である。これによりsv1の流路が切り替わり、ロートR2内の刺激液がsv1を経由して口蓋部に向けて流れる（図21-c）。
4. sv1もsv2も刺激開始から10秒後に同時に閉じるので、再びsv2の一方の流路から人工池水が口蓋部に向けて流れる（図21-d）。
以上のような方法で、ロート（R1、R2）内の刺激溶液が、5秒間ずつR1、R2の順番でシリコンチューブ内を通って口蓋部にすみやかに流れ込むようにした。刺激を繰り返す場合には、口蓋部と刺激装置を人工池水で十分に洗浄した後、さらに3分間、人工池水を口蓋部に流し続けて休息時間をとった。また、交差順応実験は、（1）交差順応前の応答の確認、（2）交差順応、（3）交差順応後の応答の再現性の確認、という複雑な手順をふまえて行わなくてはならないため、実験は以下の順番で行った。
1. 順応液をロートR1に入れ、人工池水をロートR2に入れ、味覚器応答を記
録する。
2. 人工池水をロートR1に入れ、刺激液をロートR2に入れ、味覚器応答を記録する。これにより、刺激液に対する応答の大きさを調べる。
3. 手順1で得られた順応液の味覚器応答の大きさと、手順2で得られた刺激液の味覚器応答の大きさが異なる場合、ほぼ同等の大きさになるように、各刺激溶液の濃度を調整し、手順1と2の方法に従って、再度、味覚器応答を記録する。
4. 手順1で使用した順応液をロートR1に、手順2で使用した刺激液をロートR2に入れ、交差順応実験を行い、味覚器応答を記録する。
5. 手順1の刺激を再度行い、順応液に対する応答の再現性を確認する。
6. 手順2の刺激を再度行い、刺激液に対する応答の再現性を確認する。
また、コントロールとして、人工池水をロートR1，R2に入れ、味覚器応答を記録し、応答が無いことも、適宜確認した。データは、交差順応実験で得られたロートR2内の刺激液に対する味覚器応答の大きさを、実験手順2と6で得られた、順応液で順応しないときの刺激液に対する味覚器応答の平均値を100としたときの相対値を用いた。なお、実験中の室温は20℃に設定した。
(4)刺激物質
使用した物質を表8に示した。これらの物質は、前述の実験において、オオクチバスの味覚器に対し刺激効果のあるアミノ酸と核酸関連物質の中から選択した。また表8の（ ）内にはその物質の略号を付した。以後本文中では、こ
の略号を用いて示すこととする。これら10種類の試薬（ナカライテクス社製）は、すべて人工池水に溶かして用いた。これらの溶液のpHは必要に応じて塩酸、もしくは水酸化ナトリウム溶液を用いて、pH7.0前後に調整して用いた。
結果
(1) アミノ酸-アミノ酸順応
図22に示した棒グラフは、味覚器を、L-Arg、D-Arg、L-Lysで順応したときの、各種アミノ酸の応答率を、順応していないときの応答を100とした相対値で表したものである。二標本t検定（表9）の結果、危険率1%で全ての組み合わせにおいて、対照と比較して有意差は認められなかった。図22に見られるように、オオクチバスの味覚器は、L-Argに順応したときは、D-ArgとL-Lysの応答はそれぞれ9.0%と14.5%となった。D-Argに順応したときは、L-ArgとL-Lysの応答はそれぞれ12.7%と22.0%となった。L-Lysに順応したときは、L-ArgとD-Argの応答は、それぞれ14.6%と9.1%となった。図23に、アミノ酸の交差順応実験における、積分応答の記録例を示した。
(2) L-ArgとD-Arg間での低濃度順応液、高濃度刺激刺激液を用いた交差順応実験の記録例
図24は味覚器応答の閾値に近い3×10−４Mという低濃度のL-ArgとD-Argを順応液として用い、一方刺激液として10−２Mの高濃度の溶液を用いた交差順応実験の記録例である。図24のA1からA4に見られるように、L-Arg 10−２Mで刺激する時に、L-Arg 3×10−４M(A2)、およびD-Arg 3×10−４M(A3)のいずれで順応しても非順応時(A1、A4)に見られるようなL-Arg 10−２Mの応答は見られなかった。同様なことはD-Arg 10−２Mで刺激するとき(図中B1〜B4)にも言え、L-Arg 3×10−４M(B2)、D-Arg 3×10−４M(B3)のいずれで順応してもD-Arg 10−２M応答は
得られなかった。
(3) アミノ酸-核酸関連物質順応
図25に示した棒グラフは、味覚器を、核酸関連物質で順応したときのL-Argの応答率を、順応していないときの応答を100とした相対値で表したものである。図25に見られるように、L-Argに対する応答では、二標本t検定（表10）を行った結果、対照となる核酸関連物質の応答率と比較して有意差があった。ATPに順応したときは、L-Argの応答は74.5%となり、他の核酸関連物質に順応したときと比較して、低い値となった。標準偏差の値も大きく、これは、実験個体間で応答率のばらつきが大きいことが原因であると考えられた。ADP、AMP、GMP、IMP、Ino、Adoに順応したときは、L-Argの応答は96.1%〜108.7%の範囲となり、順応していないときの応答と同等の大きさの応答が認められ、これらの核酸関連物質を用いた順応の影響はないものと判断された。
図26に示した棒グラフは、味覚器を図25の場合とは逆に、L-Argに順応したときの各種核酸関連物質の応答の大きさを、順応していないときの応答を100とした相対値で表したものである。L-Argの順応下において、実験に使用した核酸関連物質の応答は、順応していないときの応答の97.8%〜120.7%の範囲となり、二標本t検定により L-Arg 順応の影響はないものと判断された
(表11)。図27に、L-Argと核酸関連物質の交差順応実験における、積分応答の記録例を示した。
(4) 核酸関連物質-核酸関連物質順応
図28〜図34に示した棒グラフは、味覚器を、核酸関連物質で順応したときの、各種核酸関連物質の応答の大きさを、順応していないときの応答を100とした相対値で表したものである。なお、図中では、二標本t検定（表12）により、危険率1%で黒塗りの棒で示した刺激物質にのみ、対照となる刺激物質の応答率と比較して有意差があることを示している。図28は、味覚器をATPで順応したときの、各種核酸関連物質の応答率である。ADPの応答は順応していないときの12.8%、AMPのそれは25.5%となり、対照と比較して有意差は無く、ATPの影響を大きく受けた。一方、GMP、IMP、Ino、Adoの応答は97.1%〜123.4%の範囲となり、順応していないときの応答と同等の応答であり、ATP順応には影響されなかった。ADP順応（図29）では、ATPとAMPの応答はそれぞれ15.1%と9.6%で、ADPの応答と比較して有意差は認められなかった。GMP、IMP、Ino、Adoでは、83.1%〜115.0%の範囲となり、順応していないときの応答とほぼ同等の大きさの応答が認められ、ADP順応の影響は受けなかった。AMP順応（図30）の場合は、ATPとADPは、AMP順応の影響を大きく受け、応答は、それぞれ11.6%と10.1%で、対照となるAMPの応答と比較して有意差は認められなかった。GMP、IMP、Ino、Adoの応答は、順応していないときの応答の85.1%〜114.7%の範囲となり、ほぼ同等の大きさの応答が認められ、AMPの影響は受けなかった。GMP順応（図31）の場合では、IMPが最も大きく影響を受け、応答は19.4%となった。対照のGMPの応答と比較する
と応答の大きさに有意差は認められなかった。一方、Adoの応答は97.0%で、順応していないときとほぼ同等の大きさの応答であった。GMP順応で特徴的なのは、ATP、ADP、AMP、Inoの応答で、その値は、ATPが53.3%、ADPが67.0%、AMPが70.3%、Inoが62.0%という値になったことである。これらの応答は、対照のGMPの応答と比較して、有意に大きな応答であったが、前出のATP、ADPおよびAMP順応の実験で影響を受けなかった物質の値と比較して、かなり低い値であった。したがって、これら4種の物質は、GMP順応に関して、何らかの影響を受けたと判断された。IMP順応（図32）の場合では、GMPの応答は13.0%となり、対照のIMPの応答と比較して有意差は認められなかった。一方、ATP、ADP、AMP、InoおよびAdoの応答は、対照と比較して、有意に大きな応答であったが、Inoを除く物質の応答は81.8%〜97.5%であるのに対し、Inoの応答は43.8%と低く、IMP順応下で何らかの影響を受けたと考えられた。Ino順応（図33）の場合では、ATP、ADP、AMP、Adoの応答は88.1%〜114.1%の範囲となり、順応していないときの応答と同等の大きさの応答が認められ、Ino順応の影響はないものと考えられた。一方、IMPの応答は16.1%で、Inoの応答と比較して有意差は認められなかった。GMPの応答は32.9%で、Ino順応の影響をかなり受けたと考えられた。しかし、二標本t検定では、対照のInoの応答と比較して、有意に大きな応答であった。Ado順応の結果を図34に示した。ATP、ADP、AMP、GMP、IMP、Inoの応答は、88.1%〜104.5%の範囲となり、Adoに順応していないときの応答とほぼ同等の大きさの応答が認められ、
対照となるAdoの応答と比較して、全ての物質の応答が有意に大きな応答であった。したがって、Ado順応では、全ての物質に対して影響はなかった。図35に、核酸関連物質の交差順応実験における、積分応答の記録例を示した。
考察
味細胞の受容細胞膜上にある味受容器は、タンパク質であり（栗原 1990）、味物質の受容機構は、刺激物質の分子構造と受容タンパクの分子構造との相互作用によるものであると考えられている。アミノ酸の場合、α位の炭素原子に結合した4つの成分、すなわち、アミノ基、カルボキシル基、α水素原子、側鎖Rがアミノ酸受容器との相互作用に深く関わっていると考えられており（原 1981）、これらの成分を化学的に別の基で置き換えたり、側鎖構造を変えた物質を受容器に作用させることにより、アミノ酸の受容機構を解明しようとする研究も多く行われている（Caprio, 1978; Marui and Kiyohara, 1987）。前述のアミノ酸に対する味覚器応答実験の結果、刺激効果の高いアミノ酸はL-Arg、D-Arg、L-Lys等の、いわゆる塩基性アミノ酸に限定されるという点と、D-Argの味覚器刺激効果が、応答の大きさと応答閾値の両面で、L-Argのそれに匹敵するという点が、現在までにアミノ酸の味覚器応答に関して研究された他の魚種と比較して、非常に特徴的な点であることがわかった。この結果はオオクチバスのアミノ酸受容器が、どのような性質を持つものであるかを検討する重要性を示唆するものである。そこで、まずこれらのアミノ酸について、それぞれ独立したアミノ酸受容器が存在するかどうかを知る目的で、3種類のアミノ酸について、すべての組み合わせで交差順応実験を行ったが、いずれの組み合わせにおいても、対照となる同一のアミノ酸を用いた場合の応答と比較して、有意差のある応答は認められなかった。この結果は、オオクチバスの場合は、L-Arg、D-Arg、L-Lysは味受容器を共有している可能性が高いことを示唆していると考えられる。一方、他の魚種を用いてアミノ酸受容器に関して交差順応実験で研究した例を見てみると、channel catfishでは、L-Ala、L-Arg、D-Ala、L-Pro、D-Pro、D-Arg、L-His、L-Lys（Wegert and Caprio, 1991）の受容器が、sea catfishでは、L-Ala、D-Ala、Gly、L-Arg、L-Pro、L-His、L-Glu（Michel et al., 1993）の受容器が独立しているとされている。また、ヒガンフグでは、少なくともL-Ala、L-Pro、Betの受容器が独立しており（Kiyohara and Hidaka, 1991）、ニホンウナギでは、L-Pro受容器と他のアミノ酸受容器が（Yoshii et al., 1979）、コイでは、6種類（Marui et al., 1986）の、ニジマスでは、3種類（Marui et al., 1983）の受容器が独立しているとされている。これらの研究では比較的味覚器刺激効果の高いアミノ酸のみについて検討される場合が多いが、いずれにしても、魚種間での違いはあるものの、複数の独立したアミノ酸受容器が存在する場合が多い。したがってオオクチバスの場合、アミノ酸受容についてのみ考えてみると特異的にシンプルであると考えられる。さらに、L型、D型のArgについて、閾値付近の低濃度溶液(3×10−４M)での順応時に高濃度溶液(10−２M)で刺激する実験を行った。図24から分かるように、順応液に低濃度のL-Argを用いた場合もD-Argを用いた場合もL-ArgとD-Argの応答がほとんど出ないという結果になった。これはオオクチバスの場合、ＬおよびD型に関わらず3×10−４MというArgの閾値付近の濃度で刺激しても、Arg受容器が簡単に順応してしまうことを示唆する。このことはArg受容器の数が極端に少ないこと、L型ArgとD型Argは受容器を共有しており、このArg受容器は立体異性体を区別しないこと、また、オオクチバスには高濃度のArg受容可能な他の受容器が存在しないことを示唆する。
以上のことから、オオクチバスのアミノ酸受容器に関して、その受容機構について考えてみると、今回使用した3種のアミノ酸の化学構造の共通点として、側鎖Rの末端にアミノ基（Argの場合はグアニジル基に含まれるアミノ基）が存在すること、L-ArgとD-Argの光学異性体が受容器を共有していること、の2点があげられる。このことより、側鎖R末端のアミノ基の存在が重要であり、これとα位の炭素原子に結合している残りの3成分のいずれかとの組み合わせが、オオクチバスの塩基性アミノ酸の受容機構において重要な要素になっている可能性が推測される。したがってこの受容器は、一般に考えられているアミノ酸の受容機構(原, 1981)と比較して、それほど厳密な分子構造の認識機構を要求しないと推測できるが、これらのアミノ酸の関連物質を使用した実験を行うことによりさらに詳細な検討が必要であろう。Bryant et al. (1989)は、channel catfishを用いて、Arg受容に関して電気生理学的交差順応実験を行い、Arg受容において、アミノ基が必須である一方、カルボキシル基は必要ないこと、α炭素とグアニジル基の距離は重要でないことを述べており興味深い。また、Marui et al. (1983) もニジマスを用いた実験で、 高pH域で、 L-アルギン酸や
L-アルギニンメチルエステルに応答があること、同じ高pH域でのD-Argの応答はL-Argのそれと大きく差がないことなどから、Arg関連物質の受容器における刺激物質の分子構造の認識は、L-AlaやL-Proの受容器のそれと比較して、それほど厳密ではないと述べている。一方、先にも述べたように、Wegert and Caprio (1991)は、channel catfishの場合、L-Arg、D-Arg、L-Lysの受容器は互いに独立していると報告しており、channel catfishの場合はオオクチバスと全く様相を異にしている。同様にKalinoski et al. (1989)は、channel catfishの10−４MでのD-Argの応答が、同濃度のL-Argの応答と比較して24.0%、また、L-Lysの応答が17.4%であることから、受容器がArgの光学異性体を認識すること、およびL-Argの受容器にはR側鎖末端がアミノ基ではなくグアニジル基である必要があることを述べている。
アミノ酸と核酸関連物質間での交差順応実験では、L-Argと7種類の核酸関連物質を使用して、それぞれの組み合わせで実験を行ったが、すべての組み合わせで順応による影響はみられなかった。したがって、L-Argとこれらの核酸関連物質の味受容器は、互いに独立しており、オオクチバスは、L-Argとこれらの核酸関連物質の味の違いを認識している可能性が示唆された。前述のアミノ酸受容器に関する推測をあわせて考えると、D-ArgとL-Lysも、核酸関連物質と受容器が互いに独立している可能性が考えられる。今回の実験では、味覚器をL-Argに順応した場合、および、核酸関連物質に順応した場合の両方の場合において、刺激物質に対する応答は、順応していないときのほぼ100%の応答が得られた。これは、L-Argの味受容器と核酸関連物質の味受容器が独立していることを示すと同時に、L-Argの味覚ユニットと核酸関連物質の味覚ユニットが完全に独立している可能性を示していると思われる。最終的に、単一味覚神経線維を用いた実験を行わなくてはならないが、オオクチバスの場合、L-Argの味情報と核酸関連物質の味情報は、異なった神経線維によって中枢に伝達されている可能性が高い。単一神経線維標本を用いた研究は、それほど多くの魚種を用いて行われているわけではないが、例えばヒガンフグ（Kiyohara et al., 1975）では、ウリジン-5'-一リン酸（UMP）、ADP、IMPの神経線維とPro、Ala、Glyの神経線維は独立している。また、channel catfish（Kohbara et al., 1992）も、AMP、ADP、ATP、GMP、UMP、IMPからなるヌクレオチド混合液に応答する神経線維とアミノ酸に応答する神経線維は独立しているという。一方、ブリ（Zeng and Hidaka, 1990）では、Ala、Pro等の神経線維は別であるが、UMPの神経線維とアミノ酸のTrpの線維が共通しており、核酸関連物質の味情報とアミノ酸の味情報が同一の神経線維によって中枢に運ばれることになり、非常に興味深い。オオクチバスにおいても、単一神経線維標本を用いて知見を蓄積することが必要である。
核酸関連物質間での交差順応実験では、前述の結果から、図36に示したような4種類の味受容器に大別されると考えられる。味受容器の種類の違いを、物質の構造から検討してみると、まず、アデノシンリン酸受容器の場合、関連したATP、ADP、AMPは、いずれもヌクレオチドで、アデノシンリン酸として総称される。三者の違いは、ペントース成分のC-5の位置のリン酸基の数である。したがってアデノシンリン酸のリン酸基の数は、この受容器の分子構造の認識機構において重要な要素ではないと思われる。一方、AMPのリン酸基
が、水酸基に置き換わった構造を持つAdoではその受容器（Ado受容器）は独立していると考えられることから、アデノシンリン酸受容器と、Ado受容器では、ペントース成分C-5位のリン酸基と水酸基の違いが、受容器にとって重要な要素であると考えられる。このことはIMPとInoの受容器が異なっていることに関しても同様のことがあてはまると考えられる。次に、GMPとIMPでは、塩基がグアニンとヒポキサンチンという構造の違いがあるが、これは、GMP-IMP受容器の分子構造の認識機構にとって重要な要素ではないと思われる。前述の味覚器応答の結果からオオクチバスの味覚器における濃度-応答曲線は、GMPとIMPでほぼ同一であることを示している。また、Sato and Akaike (1965)は、哺乳類であるラットの鼓索神経応答を記録し、グルタミン酸ソーダとGMPの組み合わせ、または、グルタミン酸ソーダとIMPの組み合わせの両方で、著しい相乗効果が起こることを報告しており、非常に興味深い。この相乗効果は、UMPやCMPでは起こらないという。一方、GMP-IMP受容器と、AMPの受容器（アデノシンリン酸受容器）においては、これら3種のヌクレオチドの分子構造の違いはGMPの塩基成分のグアニンあるいはIMPの塩基成分のヒポキサンチンと、AMPの塩基成分であるアデニンの部分である。したがってこの塩基成分の違いは受容器の分子構造の認識機構において重要な要素であると考えられる。このことはIno受容器とAdo受容器に関しても同様のことがあてはまると考えられる。
今回の交差順応実験では、IMPとInoの味受容器は、それぞれ独立していることが明らかとなった。しかしながら、IMPあるいはGMP順応下では、Inoに対する応答に、応答の減少という影響が見られた。また、Ino順応下では、IMPとGMPの応答に同様の影響が見られた。したがって、これら2種類の味受容器が存在する味覚ユニットが共通している可能性が高いと考えられる。また、IMP順応下ではInoには対照と比較して有意差のある応答が見られたが、Ino順応下では、IMPの応答は対照と比較して有意差は認められるものではなかった。この原因としては、IMPとInoで共有している受容器と、Inoのみの独立した受容器の2種類が存在する可能性も考えられる。いずれにしても、これらの可能性を確かめるためには、今後、単一神経線維を用いた実験などを行う必要があると思われる。
総合考察
Bardach and Villars (1974)によると魚類の摂餌行動は、餌の存在を確認する段階(arousal)、餌の位置を突き止めるまでの探索(serch)、口腔内への取り込み(uptake)、そして摂取(ingestion)の段階に分けられる。いずれにしても第一段階は餌から受ける刺激をどの感覚器で感知するか、によって始まるが、どの感覚器を使用するかは魚種によって異なるであろうし、また、その魚が置かれている状況、言い換えれば様々な外部環境要因によってでも変わっているであろう。本研究で対象としたオオクチバスはルアー釣りの好対象魚である。したがってオオクチバスの摂餌行動において視覚器や聴覚器、側線器から得られる情報が餌からの刺激の受容に優位に関わっていることが容易に推測できる。魚類が餌を感知する場合、プランクトン食の魚よりも雑食性の魚の方が、濁った水よりも澄んだ水にすんでいる魚の方が一般的に視覚に頼る割合が高いといわれている。また、音や振動で餌が近くにいることを感知し、餌の動きを目で見て捕食するというプロセスは、カツオだけでなくスズキやカサゴなどの肉食性の魚類全般にいえることであり、これらの魚をルアーで釣ることに関しては、匂いは大して重要な要素ではないとされている(内藤, 1998)。また鍋島 (1998)によれば、ミミズのエキスは肉食魚に対しても誘引効果が認められ、肉食魚が餌を探す手段として、あくまでも視覚や側線に感じる振動などが優先されるものの、餌が見えない状況下では索餌を嗅覚に頼らざる得ないのではないかと述べている。しかしまた同時に、嗅覚が餌を探すために利用されることはあっても、実際にそれが引き金となって餌を捕食するかどうかは直接的には結びつかないのではないかとも述べている。このことはオオクチバスにも当てはまる可能性が十分にある。
以上の点をふまえ、オオクチバスの化学感覚器の摂餌行動における役割を考えてみると、嗅覚器については、アミノ酸受容において応答スペクトルの特徴が他の魚種と類似しており、またアミノ酸に対する感度も味覚器よりも嗅覚器の方が高いことが明らかとなった。したがってParker (1910)をはじめ、多くの研究者が魚類の嗅覚器が摂餌行動において遠隔受容器として機能していることを示唆しているが、オオクチバスの嗅覚器も性能的にはその要件を十分に満たしているものと考えられる。次に、味覚器であるが、アミノ酸に対しては現在までに調べられた他の魚種と比較するとその応答スペクトルは非常に狭く、極端にいえば応答するアミノ酸はArgに代表される塩基性アミノ酸のみで、しかも調べた3種類の塩基性アミノ酸は受容器を共有している可能性がある。また、感度においても最も高いL-Argで10−５M〜10−４Mで他の魚類と比較した場合、感度としてはそれほど高くない。したがってオオクチバス味覚器のアミノ酸受容は極端に単純化されており感度もそれほど高くないといっても過言ではない。一方、Kubiza et al. (1997)はオオクチバスを用いた摂餌促進物質に関する行動実験において、魚粉を主体とする配合飼料にIMPを加えた場合に摂餌刺激の増強効果が認められる事を報告していている。彼らはAla、Gly、Pro、Ser、Leu、Leu、Val、His、Trpからなるアミノ酸混合物(残念ながらArgは含まれていない)、そしてベタインの効果も調べているが、これらには促進効果は認められない事も述べている。オオクチバスの味覚器はアミノ酸に対する応答とは対照的にIMPを含む核酸関連物質にはよく応答し、10−２MではL-Argの応答を凌ぐものが多く(ADP、Ado、AMP、ATP、IMP、Ino、GMP)、また閾値もL-Argと同等(IMP、GMP、ATP、Ado)、あるいはそれ以下(ADP、AMP、Ino)である。摂餌刺激に核酸関連物質が関与している例は、現在までに数例報告されており、マダイ(細川ら, 1978)でIMP、ADP、ATPが、ブリ(細川ら, 1976)とマアジ(池田ら, 1988)ではIMPがあげられる。一方、ブリ(Hidaka et al., 1985)とマアジ(Ishida and Hidaka, 1987)の味覚器はIMPに応答するが、マダイ(Goh and Tamura, 1980)の味覚器は10−２Mでも、摂餌刺激効果があるとされる核酸関連物質に応答しない。したがって、魚類における核酸関連物質の摂餌刺激効果と味覚器刺激効果の関係は、アミノ酸の場合と同様に複雑であるが、オオクチバスの場合、摂餌刺激に増強効果の認められたIMPは、ブリやマアジの場合と同様に味覚器を刺激する。また、オオクチバスでは、電気生理学的交差順応実験から、IMPとInoの味受容器は異なっていることが示唆されたが、Kubitza et al. (1997)の飼料摂取実験では、IMPには摂餌刺激に増強効果があるものの、Inoには認められないとされ、興味深い。いずれにしても配合飼料をオオクチバスに与えるような状況下では、味覚器から得られる情報が餌の摂取の段階で摂餌行動に関与していることは十分に考えられる。
一方、筆者は、ここ数年来、ルアーを用いたオオクチバス釣りを実験に使用する魚を確保するため精力的に行ってきたが、ルアーによって釣獲するような状況下では、オオクチバスの場合、化学感覚がそれほど重要でないと感じる事がある。それは筆者の経験上、何も塗布されていないプラスティックのルアーでも、オオクチバスが飲み込んでしまっていることがたびたびあるからである。味覚は顔面味覚系と舌咽-迷走味覚系に分けられ、前者は餌の口腔内への取り込みに、後者は餌の飲み込みと吐き出しに関与するとされ、機能的に異なる
(清原, 1994)。例えばヒガンフグの場合、キニーネを含ませたデンプン団子を与えると、いったんそれを口に取り込んだ後、吐き出すとされ、この行動は舌咽-迷走味覚系を介しての行動である。一方、オオクチバスがルアーを飲み込んでしまうという現象は、飲み込むという判断をするときに味覚だけでなく、何か他の違う飲み込むかどうかを判断する要因があるのではないだろうかと考えられる。それは、味以外の情報、例えば口腔内で餌生物が動くなどの機械的な刺激も、オオクチバスにとって、それを飲み込みかどうかの重要な判断材料のひとつになっているのかもしれない。あるいは、活発な肉食性魚であるがゆえに、餌の口への取り込みとそれを飲み込むという行動が味の判断を介さずに瞬時に行われるために、ルアーを飲み込むという現象が起こるのかもしれない。
近年、釣り具メーカーは、オオクチバスを誘引したり、ルアーを口にくわえている時間の延長効果など、釣果が向上するという名目で、化学物質を含ませたルアーを多種製造販売している。しかし実際、これらのものを使用した釣り人からは、「釣果が全く違う」と言う意見もあれば、「関係がない」という意見もある。つまり、人それぞれにその受け捉え方は様々であり、また釣り場の状況によって違う結果が出るということが真実のようである。広大な湖沼で、たとえルアーに化学感覚器を刺激する物質を含ませて使用したとしても、今回の実験で明らかとなったアミノ酸や核酸関連物質に対する感度や電気生理学的な刺激閾値と行動学的な刺激閾値の隔たりを考えあわせると、嗅覚を刺激するにせよ、味覚を刺激するにせよ、それがどの程度の集魚効果を引き出せるのかは甚だ疑問である。したがってルアーに含ませる刺激物質は、それによってオオクチバスを誘引するために使用するのではなく、餌の位置を突き止める探索が終了し、ルアーを口に取り込むまさしくその直前か、あるいは口に取り込んでそれを保持する段階で機能する可能性があるものと考えた方が良さそうである。Valentincic and Caprio (1994)は嗅覚を遮断したchannel catfishを用いて、アミノ酸刺激が引き起こす摂餌行動のパターンを観察し、L-Ala(>10−６M)、L-Arg
(>10−６M)、L-Pro(>10−４M)による刺激が、Turning行動、鰓の灌水行動、反射的に口をパクパクさせる行動を引き起こすと述べられている。なかでも、最も低い濃度で口をパクパクさせる行動を引き起こすアミノ酸はL-Argで、オオクチバスにとって最も刺激効果の高いアミノ酸であることを考えあわせると興味深い。オオクチバスの場合もchannel catfishのように反射的に口をパクパクさせる行動を引き起こすような物質をルアーに含ませることができれば、ルアーを確実にくわえさせて、釣り上げる確率が向上するのではないかと考える。
謝辞
終わりに、本研究を行うにあたって終始ご指導いただきました三重大学生物資源学部水族生理学研究室日高磐夫教授ならびに 神原淳助教授に深く感謝の意を表します。また、オオクチバスの捕獲に協力していただいた三重大学バスフィッシングサークルのみなさんに感謝するとともに、実験に協力していただいた三重大学大学院生物資源学科藤井健太氏にもお礼申し上げます。